临床研究证实器官捐献者BMI越大越有利于胰岛制备的成功率,甚至一些胰岛移植中心基本选用BMI > 27 kg/m2的捐献者。但在我国器官捐献者如果BMI水平越高,可能会有潜在的2型糖尿病或胰岛素分泌功能缺陷的风险,在评估供者时应结合血糖、空腹C肽以及糖化血红蛋白水平进行综合评估。
2.1.2 供者胰腺的排除标准
(1)恶性肿瘤(未转移的皮肤基底细胞癌、脑胶质瘤者除外);(2)AIDS、乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎感染或具有感染以上疾病的危险因素以及全身性感染;(3)有明确糖尿病史或糖耐量检查异常;(4)既往胰腺手术史;(5)慢性胰腺炎。
2.1.3 供者胰腺的获取
胰岛移植供者胰腺的获取原则与胰腺移植相同,但不要求保留胰腺供血的血管。供者胰腺的获取过程必须确保胰腺腺体的完整,但也应尽量缩短获取时间,尽量在主动脉夹闭前保留更多的含氧血量。经过威斯康星大学保存液(University of Wisconsin solution,UW液)灌注胰腺后,整条胰腺与部分十二指肠需整块切取,置于4 ℃无菌UW液中,尽快运输至胰岛制备中心进行胰岛制备[13]。
2.2 临床胰岛细胞分离、纯化和移植前培养
临床胰岛细胞制备需整个过程要在药品生产质量管理规范(good manufacturing practices,GMP)实验室中完成。当供者胰腺到达GMP实验室后,首先检查胰腺是否完整,灌注是否充分,是否存在水肿、纤维化等。确认供者胰腺适合进行胰岛细胞分离后,应将胰腺周围脂肪组织、淋巴结尽可能去除。但在此过程中应完整保留胰腺外膜,以利于灌注消化液时达到良好的效果。
2.2.1 胰岛制备
胰腺灌注胶原酶:将胶原酶溶液通过主胰管灌注到胰腺内部,整个灌注过程保持一定的灌注压力[前5 min保持压力在60~80 mmHg(10 mmHg=1.33 kPa),然后保持压力在160~180 mmHg,继续灌注4~6 min],使得胰腺膨胀良好、胶原酶充分灌注至胰岛周围[7]。
胰腺消化:充分灌注后将胰腺组织切成3 cm×3 cm大小的组织块后,连同胶原酶溶液一并转入Ricordi消化罐中进行消化。消化胰腺的整个过程维持温度在37 ℃左右,以发挥胶原酶的最大活性,同时以一定的力度、频率摇晃Ricordi消化罐,当样本中组织量增多,胰腺腺泡变小,大多数胰岛细胞与胰腺腺泡分离时,即可停止消化。然后应用冷却的细胞培养液稀释消化罐中的胶原酶浓度,降低胶原酶活性。同时保持一定的力度、频率继续摇晃Ricordi消化罐。将消化产物收集到含10%人白蛋白的冷却细胞培养液中,反复离心,收集沉淀物,清洗后悬浮于冷却的UW液中,30 min后进行纯化[9]。
胰岛纯化:胰岛纯化方法采用连续密度梯度离心法。利用Cobe2991细胞分离机纯化胰腺的消化产物,介质一般采用聚蔗糖(ficoll)或碘克沙醇(iodixanol),离心后将纯化产物根据密度不同分别收集到12个离心管中,再分别提取每个离心管中的样品做纯化鉴定,根据每管中胰岛细胞的纯度可以将纯化产物分为高纯度(≥70%)、中等纯度(40%~69%)和低纯度产物(30%~39%)。胰岛细胞分离后可以立即移植或培养一定时间后移植。
胰岛培养:如果胰岛需要体外培养后再行移植,胰岛制备后应用含有10%~15%人血清白蛋白的CMRL1066培养液(糖浓度为5.5 mmol/L),将胰岛细胞悬浮培养于37 ℃含5%CO2培养箱中培养,最长培养时间不应超过72 h[9]。
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