DNA Shuffling试剂盒在蛋白质进化中的主要应用

在三十亿年的进化过程中，大自然通过重复的随机突变和体内选择编码蛋白的优越功能，产生了大量蛋白质。这种自然进化的例子启发了研究人员在过去二十年中开发了体外排列蛋白的策略。

在应用的各种策略中，出现了三种主要的强大技术。

通过dNTP类似物的随机突变

这种方法基于将突变性dNTP类似物，如8-0xo-dGTP和dPTP，通过PCR并入扩增的DNA片段。在仅存在四种天然dNTP的情况下进行第二步骤PCR，淘汰突变性dNTP，实现高达20%的突变率。

1.S dNTP突变试剂盒 #PP-101

通过错误倾向PCR的随机突变

由Caldwell和Joyce（1992）开发，这种方法使用在引起DNA聚合酶错误率增加的条件下的PCR反应，在感兴趣的基因中引入突变。通过错误倾向PCR实现的突变率在0.6-2.0%范围内。

2.SError倾向试剂盒IPP-102

通过DNA Shuffling的随机突变

由Stemmer（1994）开发，DNA Shuffling通过随机切割一个基因或一组相关基因，然后通过自引物PCR反应重新组装片段来生成库。这种方法允许来自不同相关基因的序列重组。整体突变率大约为0.7%。

3.艾美捷DNA Shuffling试剂盒 #PP-103

Jena Bioscience现在为每种技术的“即用型”提供所有必要的组件，单独的试剂盒，并附有简化的文档，以Z大化成功。

一般实验室用途。

运输：在凝胶包上运输

储存条件：存储在-20℃

附加储存条件：避免冻融循环

保质期：12个月

通过DNA Shuffling的随机突变

DNA Shuffling是一种在体外有目标地进化蛋白质的强大技术。它通过来自一个或几个相关基因的基因片段的重组生成结构多样性。DNA Shuffling可以分为单基因 Shuffling和多基因 Shuffling（图1）。在单基因 Shuffling中，只有一个基因被消化，然后重新组装，导致点突变的比率大约为0.7%。DNA Shuffling在蛋白质进化中的主要应用是多基因 Shuffling（通常称为分子育种）。在这项技术中，几个同源DNA序列被消化，然后重新组装。结果是包含额外点突变的嵌合基因库。

DNA Shuffling中的关键步骤是对感兴趣的基因进行消化，以产生合适大小的片段。因此，试剂盒中的所有试剂都经过优化，以便在方便的时间框架内获得所需大小的片段（图2）。通常，使用平均大小为70-280 bp的片段会取得最佳结果。请注意，完全的DNase I消化会产生非常短的片段，这些片段无法通过随后的PCR进行扩增。

图1：DNA混洗的一般类型

图2:1000bp DNA片段的DNA酶I消化与孵育时间的函数关系（37℃下1g DNA+0.1单位DNA酶I）

DNA Shuffling试剂盒参考文献：

Crameri et al. (1998) DNA shuffling of a family of genes from diverse speciesaccelerates directed evolution. Nature 391:288.

Patten et al. (1997) Applications of DNA shuffling to pharmaceuticals andvaccines. Curr. Opin. Biotechnol. 8:724.

Stemmer (1994) DNA shuffling by random fragmentation and reassembly. Invitro recombination for molecular evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:10747.

Stemmer (1994) Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature370:389.