ALPCO胰岛素ELISA：样本处理&试剂准备&结果计算

ALPCO胰岛素ELISA是一种夹心型免疫测定法。96孔微孔板涂有胰岛素特异性单克隆抗体。将标准品、对照品和样品加入带有检测抗体的微孔板孔中。然后将微孔板在酰胺板振荡器上以700-900rpm的速度孵育。第一次孵育完成后，用洗涤缓冲液洗涤孔并吸干。加入TMB底物，在微孔板振荡器上以700-900rpm的速度第二次孵育微孔板。一旦第二次孵育完成，加入停止溶液，用分光光度计在450nm处测量光密度（OD）。产生的颜色强度与样品中胰岛素的量成正比。

ALPCO胰岛素ELISA用于定量测定血清和血浆中的胰岛素。

艾美捷胰岛素ELISA（ALP-80-INSHU-E01.1）供应的材料：

*请参阅每个试剂盒随附的分析证书，了解批次特定的控制范围和复溶量。

储存条件：

试剂盒应储存在2-8C的条件下。试剂盒在盒子标签上的有效期之前是稳定的。

样本处理：

血清和血浆（肝素或EDTA）样本适用于此测定。不需要对样本进行稀释或处理。然而，如果样本的胰岛素浓度高于最高标准，应将样本在零标准中稀释，然后重复分析。样本可以在分析前在2-8C下储存24小时。建议在-20C以下储存更长时间。避免反复冻融。建议在使用前1）彻底涡旋每个样本，2）在不停顿的情况下进行移液操作。

试剂准备：

所有试剂在使用前必须平衡至室温，然后用于测定的准备和后续使用。洗涤缓冲液浓缩液需用20份蒸馏水稀释。例如，要准备工作强度洗涤缓冲液，用400毫升去离子水稀释20毫升洗涤缓冲液浓缩液（21倍）。工作强度洗涤缓冲液在室温（18-25C）下稳定4周。

糖尿病控制品（1级和2级）以冻干形式提供。请参考随每个试剂盒提供的分析证书，了解适当的去离子水体积用于复溶。用橡胶塞和盖子封闭小瓶，轻轻摇晃小瓶，使用前让其静置30分钟。小瓶中的内容物应完全溶解，无可见颗粒。复溶的控制品在2-8C下储存7天稳定。如果需要，控制品可以分装后在-20C以下储存长达6个月。控制品不应反复冻融。

质量控制：

建议在每次测定中包含ALPCO胰岛素ELISA提供的控制品。控制品的浓度范围在每个试剂盒提供的分析证书上提供；然而，建议每个实验室建立自己的可接受范围。

所需材料：

- 用于分配25 - 100微升的精密移液管（带一次性吸头）

- 用于分配100微升的可重复或多通道移液管

- 用于试剂配制的容量瓶和移液管

- 用于试剂配制的蒸馏水或去离子水

- 微孔板洗涤器或洗涤瓶

- 能够达到700-900转/分钟的微孔板振荡器

- 带有450纳米滤光片的微孔板阅读器

- 用于样本制备的涡旋混合器。

结果计算：

从标准品构建标准曲线。零标准应作为空白，其平均值应从每个孔中减去。建议使用软件程序来计算标准曲线并确定样本的浓度。胰岛素ELISA是一种配体结合测定，其反应与分析物浓度呈S形关系。目前公认的此类曲线的参考模型使用4或5参数逻辑（pl）拟合，因为这些模型能在更大范围内优化准确性和精确度。尽管三次样条和其他模型是可接受的方法，但它们通常在检测范围的低值和高值端显示出较低的测定内准确性和精确度。

胰岛素ELISA文献参考：

Finlay JWA, Dillard RF. Appropriate Calibration Curve Fitting in Ligand Binding Assays. AAPS Journal. 2007; 9(2): E260-E267.