鬼笔环肽是一种来自毒鹅膏菌（Amanita phalloides）的七肽毒素，能够特异性且高亲和力（解离常数 Kd 为 20 nM）地结合到聚合态肌动蛋白（F-肌动蛋白）上。鬼笔环肽可将肌动蛋白聚合的临界浓度降低至不到 1 g/ml，从而作为一种聚合增强剂。鬼笔环肽已被标记上一种专有的红色荧光染料（1），使其可用于染色组织培养细胞和组织切片（2，见图 2）以及无细胞体系中的肌动蛋白丝。Acti-stain™ 555 鬼笔环肽标记的肌动蛋白丝保留了许多未标记肌动蛋白的功能特性，包括它们与肌球蛋白相互作用的能力。
Acti-stain555鬼笔环肽（#PHDH1-A）以红色固体形式提供，分子量为 1775。对该化合物进行的吸收光谱和荧光扫描显示，其吸收峰位于 550 nm，荧光峰位于 570 nm（见图 1）。1×工作液的 PHDH1 足够用于染色 300-350 片盖玻片（22×22 mm）上的细胞（见图 2）。
注意：鬼笔环肽有毒，必须小心处理（人类 LD50 = 2 mg/kg）。
图 1：Acti-stain™ 555 的吸收光谱和荧光扫描
图例：标记的鬼笔环肽被稀释到甲醇中，其吸收光谱和激发光谱分别在 250-750 nm 和 550-750 nm 范围内扫描。吸收峰位于 550 nm，荧光位于 570 nm。
图 2：Swiss 3T3 细胞中的肌动蛋白应力纤维
图例：Swiss 3T3 细胞在玻璃盖玻片上生长至半融合状态，并用 Acti-stain™ 555 鬼笔环肽和 DAPI（核染料）按方法描述进行固定和染色。细胞在配备 TRITC 滤光片组（535Ex/585Em 滤光片组）、数字 CCD 相机和 100×物镜的荧光显微镜下观察。注意细胞中遍布的肌动蛋白应力纤维（红色）。
储存与复溶
短暂离心以使产品聚集在管底。用 500 L 100% 甲醇复溶，制备 14 M 的溶液。建议将溶液保存在 -20C 的一个瓶中，可稳定保存 6 个月。冻干产品在 4C 干燥条件下（湿度<10%）可稳定保存 6 个月。
应用 ：免疫荧光
用于组织培养细胞中肌动蛋白丝荧光染色的方法有多种。固定程序对于获得细胞内 F-肌动蛋白分布的真实表示至关重要。应根据实验要求选择固定方法。用甲醛或戊二醛固定组织培养细胞可获得出色的肌动蛋白丝染色效果和良好的片状伪足保存效果。
试剂
1. Acti-stain™ 555 鬼笔环肽（货号：PHDH1）
2. 在玻璃盖玻片上生长至半融合状态的 Swiss 3T3 细胞
3. 要么从 Cytoskeleton, Inc. 购买 F-肌动蛋白染色试剂盒（货号：BK005），要么准备以下 4-7 项试剂
4. 磷酸盐缓冲液（PBS，20 mM 磷酸钾，pH 7.4，150 mM NaCl）
5. 固定液（PBS 中的 3.7% 甲醛，pH 需调至 7.0）
6. 通透缓冲液（PBS 中的 0.5% Triton X-100）
7. 抗褪色封片介质（Fluka BioChemika，货号：10981）
8. PBS 中的 100 nM DAPI（4’6-二氨基-2-苯基吲哚）
9. 显微镜载玻片（25×75×1 mm）
10. 封片液（透明指甲油）
设备
1. 荧光显微镜，配备用于 Acti-stain™ 555 的 TRITC 激光激发滤光片（53520 nm）和发射滤光片（58520 nm），以及用于 DAPI 的激发滤光片（35520 nm）和发射滤光片（44020 nm）。
2. 数字 CCD 相机。
Acti-stain555鬼笔环肽文献参考：
1. Wulf, E. et al. (1979). Proc Natl Acad Sci USA. 76(9):4498-4502.
2. Kron, S.J. et al. (1991). Meth. Enzmol. 196: 399-416.
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