我国已进入人口中度老龄化阶段并呈现一种持续加深态势。目前，我国因老龄化造成的失能及半失能的老年人近4 000万，完全失能老年人达1 200万[1]。此外，伴随着年龄的增加，记忆力从50岁开始呈下降趋势，70岁以后显著减退。60岁以上老人认知功能障碍的发病率达56%～76%，80～89岁老人发病率可达86%[2]。由此可见，认知功能障碍是衰老过程中不可避免的病症，同时也是很多疾病的伴发症，如糖尿病、帕金森氏病、中风等，严重影响患者的生活质量。而轻度认知功能障碍（mild cognitive impairment，MCI）作为痴呆和正常之间的一种过渡状态，是痴呆发生的早期阶段，而痴呆不可逆转、尚无特效药物，在早期有效的介入治疗，将痴呆的发生、发展遏制在初期阶段、延缓痴呆发生的进程意义重大。
中医认为肝是人体衰老的启动因子，《灵枢·天年》曰：“五十岁，肝气始衰，肝叶始薄，胆汁始灭减，目始不明，六十岁，心气始衰……”，表明人体衰老以肝为先导[3]。而肝与MCI亦有密切关联，中医从“肝”论治轻度认知功能障碍的理论认为肝藏血调节血量，肝肾同源，精血互化，肝藏之血不足必导致肾精不足，而肾又与脑通过督脉相联，肾精不足日久可致髓海不足而致MCI发生[4-5]。肝主疏泄调畅一身之气机，肝气条达，五脏之气血才可至脑窍而防止脑营养缺失[6]。中医中的“肝”虽不等同于解剖学的“肝脏”，但二者亦有相同之处。随着现代医学对中医藏象学说认识的进步，发现“肝藏血”意为肝具有储存血液，调节血量的功能，包含了肝脏作为身体储存血液最多器官的功能。《素问·六节藏象论》曰：“肝者……以生血气”，认为肝促进气血化生，这与肝脏内合成血浆凝血和溶血因子的功能相契合。“肝主疏泄”意为肝具有调节气血津液的输布和促进脾胃的运化等的功能，这与现代医学中肝脏是机体能量代谢中枢，具有将物质转换为能量并供给人体利用的功能亦有部分相同[7]。因此，从肝论治MCI的研究可从肝脏入手。已有临床研究也证实了肝脏和认知疾病的具有密切关系，一项前瞻性队列研究发现肝功标志物与阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）密切相关，AD患者丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）水平显著降低，且与认知功能呈显著正相关关系，提示肝酶的改变在认知功能障碍的发病机制中发挥重要作用[8-9]。中医药从肝论治认知功能障碍也取得了很好的效果，如柴胡疏肝汤可调节癫痫合并认知障碍大鼠神经元突触传递和突触可塑性，促进神经元损伤后的再生，恢复受损的认知功能，并能改善记忆[10]。解毒通络调肝方可通过调控海马组织脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）、葡萄糖转运蛋白4（recombinant glucose transporter 4，GLUT4）蛋白表达，影响磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）信号通路提高2型糖尿病认知障碍大鼠的认知能力[11]。再用柔肝调神针刺法可通过影响脑卒中后认知障碍患者突触相关微核糖核酸的表达水平改善认知功能[12]。肝脏与认知功能障碍的病理机制存在联系，而肝和脑之间亦存在沟通途径。
龟龄集是我国传统中药名方，《中国药典》2020年版记载其具有强身补脑、固肾补气、增进食欲之功效，可用于治疗肾亏阳弱、记忆减退、夜梦精溢、腰酸腿软、气虚咳嗽、五更溏泻、食欲不振之症[13]。现代临床和药理研究也证实了龟龄集在改善认知和记忆功能方面效果显著，如龟龄集可以降低轻中度AD患者的量表-认知评分（AD assessment scale-cognitive score，ADAS-cog）和中医证候积分，增加简易智力状态检查量表（mini-mental state examination，MMSE）评分[14]，并能改善血管型MCI患者的认知功能和中医证候，调节胆碱能系统、炎症反应和细胞因子水平[15]，还能改善轻-中度老年认知障碍患者的肾虚髓减证[16]。药理研究发现，龟龄集可通过保护海马组织，调节皮质酮和酮水平改善AD大鼠认知功能障碍[17]，并能通过增加海马CA1区神经元数量，调节BDNF/酪氨酸激酶受体B（tropomyosin receptor kinase B，TrkB）信号通路，促进突触、髓鞘相关蛋白表达改善SAMP8小鼠学习记忆能力[18]。本课题组前期基于多种衰老动物模型发现龟龄集可通过调节氧化应激、胆碱能和性激素水平，调节多条代谢通路改善衰老性记忆障碍[19-20]，并基于D-半乳糖（D-galactose，D-gal）合并半高脂饲料复制了衰老型MCI大鼠模型，明确了龟龄集改善轻度认知功能障碍的药效作用和潜在的机制[21-22]。基于肝脏与大脑认知的密切关系，龟龄集作为传统中药大复方，具有多成分、多靶点的特点，在改善轻度认知功能障碍的同时是否对MCI大鼠的肝脏发挥了保护作用尚未知。据此，本研究通过检测肝功能、肝组织病理，并结合肝脏代谢组学探讨龟龄集肝保护作用及其机制，根据课题组前期发现的龟龄集可通过调节氧化应激、炎症反应、胆碱能、细胞凋亡和神经营养，并改善肾功、调节肾脏代谢通路紊乱改善MCI大鼠认知功能[21-22]，进一步综合分析龟龄集靶向“肝-肾-脑轴”治疗轻度认知功能障碍的潜在作用。
1 材料
1.1 动物
SPF级雄性SD大鼠60只，体质量为（18020）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2019-0006。大鼠饲养于温度（241）℃、湿度（505）%、12 h明暗交替的环境，自由进食饮水，适应性饲养7 d后开始实验。本研究动物实验经山西大学伦理委员会批准（批准号2020DW121）。
1.2 药品与试剂
龟龄集（国药准字号Z14020687，批号103171021）购自山西广誉远国药有限公司；盐酸多奈哌齐片（安理申，国药准字号H20050978，批号1705045）购自卫材（中国）药业有限公司；银杏叶片（国药准字号Z20044573，批号10010321）购自扬子江药业有限公司；羧甲基纤维素钠（批号H10950294）购自天津市凯通化学试剂有限公司；D-gal（批号102030630，质量分数≥98%）购自美国Sigma 公司；AST、ALT、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）ELISA试剂盒（批号分别为AD190524、AD190218、AD190516）购自北京安迪华泰科技有限公司。
1.3 仪器
Ulti Mate 3000 UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS超高效液相色谱-串联质谱联用仪、Xcalibur工作站（美国ThermoFisher Scientific公司）；色谱柱ACQUITYUPLC HSST3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美国Waters公司）；TG16KR型高速冷冻离心机（上海继谱电子科技有限公司）；Nexera LC-40型超高效液相系统（日本岛津公司）；XH-B型旋涡混匀仪（上海秉越电子仪器有限公司）；Bionoon-48型高通量组织研磨仪（上海般诺生物科技有限公司）。
2 方法
2.1 动物分组、造模与给药
将60只大鼠随机分为对照组、模型组和龟龄集高、低剂量（150、75 mg/kg）组、银杏叶片（以总黄酮苷计7.2 mg/kg）组、多奈哌齐（0.625 mg/kg）组。除对照组外其余各组每天颈背部sc D-gal（50 mg/kg），并给予半高脂饲料，对照组sc等量生理盐水，并给予基础饲料，连续8周。从第5周开始各给药组ig相应药物，对照组和模型组ig等体积羧甲基纤维素钠，1次/d，至第8周末。
2.2 样本的收集和制备
末次给药后，禁食不禁水12 h，以10%水合氯醛ip麻醉（5 mL/kg）后，腹主动脉取血，静置30 min后，3 500 r/min离心20 min，取上清。剖取肝脏组织左叶以4%多聚甲醛固定。取肝脏组织中叶置液氮冷冻后保存于−80 ℃冰箱，备用。
将收集的肝脏组织样本在4 ℃下解冻，取80 mg肝组织样本在预冷至0 ℃的甲醇-水（1∶1）溶液300 μL匀浆1 min，之后涡旋2 min，于4 ℃、15 000 r/min离心15 min，取上清转移至1.5 mL EP 管，置冷冻离心干燥机中浓缩至干，残渣以300 L甲醇-水（4∶1）溶液复溶，涡旋5 min，于4 ℃、15 000 r/min离心15 min，取上清待测。
2.3 检测指标
2.3.1 生化指标检测 按照试剂盒说明书测定各组大鼠血清肝功指标ALT、AST和ALP。
2.3.2 肝脏指数测定 肝脏组织以冷生理盐水漂洗后，吸干水分，称定，计算肝脏指数。
肝脏指数＝肝脏质量/体质量
2.3.3 肝脏组织病理学观察 经4%多聚甲醛固定的大鼠肝脏左叶，乙醇脱水后石蜡包埋，切片，用HE染色，于显微镜下观察。
2.4 肝脏代谢组学分析
2.4.1 色谱条件 流动相为0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B）；采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相梯度为0～2.5 min，5% B；2.5～4.5 min，5%～45% B；4.5～12.0 min，45%～75% B；12.0～17.5min，75%～95% B；17.5～20.0 min，95% B；20.0～21.5 min，95%～5% B；21.5～25.0 min，5% B。体积流量为0.3 mL/min，进样体积为5 L，柱温为40 ℃。
2.4.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），采用Full Scan/dd-MS2模式，离子喷雾电压正离子为3 500 V、负离子为2 500 V，辅助气和鞘气均为高纯氮气，毛细管温度320 ℃，加热器温度300 ℃，一级质荷比检测范围为m/z 100～1 500，去簇电压70 V，入口电压10 V，去溶剂温度 350 ℃。
2.4.3 数据处理 将原始数据导入Compound Discoverer 3.0软件，获得相应的峰面积数据。通过SPSS软件进行峰面积归一化，将峰面积数据导入SIMCA-P13.0软件进行主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）。模型验证采用交互验证的方差分析（cross-validation analysis of variance，CV-ANOVA）。以VIP＞1及t检验P＜0.05筛选对照组和模型组的差异代谢物，并根据分子式和二级碎片离子与人类代谢组数据库（human metabolome database，HMDB）进行比对鉴定，将鉴定的差异代谢物导入MetaboAnalyst数据库进行代谢通路富集分析，并结合京都基因与基因组百科全书数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）对涉及到的通路进行关联分析。
2.5 统计学分析
数据使用SPSS 22.0、Excel 2019、Graphpad prism 7软件进行统计学分析，均以表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。
3 结果
3.1 对MCI大鼠肝功能指标的影响
龟龄集对MCI大鼠血清生化指标的影响如图1所示。与对照组比较，模型组大鼠AST、ALT显著升高（P＜0.01），ALP显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，龟龄集高剂量组和银杏叶片组大鼠AST、ALT显著降低（P＜0.05、0.01），龟龄集低剂量组ALT显著降低（P＜0.01）。结果表明，龟龄集和银杏叶片能够改善肝功能指标。
3.2 对MCI大鼠肝脏指数的影响
如图2所示，与对照组比较，模型组大鼠肝脏指数显著下降（P＜0.05），高剂量龟龄集、银杏叶片和多奈哌齐均能显著提高MCI大鼠的肝脏指数（P＜0.05）。
3.3 对MCI大鼠肝脏组织病理的影响
如图3所示，对照组大鼠肝细胞形态正常，胞质均匀淡染，细胞核居中，中央静脉内皮细胞较完整，肝窦结构正常，未见明显淤血扩张及炎性浸润。模型组大鼠肝细胞变大，出现脂滴空泡，肝索排列紊乱，细胞核偏向一侧，肝血窦扩大。龟龄集高剂量组大鼠肝细胞病变明显减轻，大部分肝细胞形态接近正常，脂滴空泡现象减少，肝索排列显著改善；龟龄集低剂量组肝组织病理较模型组未见明显改善；银杏叶片组大鼠肝索排列较模型组有所改善，但肝细胞脂滴空泡较多；多奈哌齐组肝组织病理较模型组未见明显改善。结果表明，高剂量龟龄集对肝组织病理的改善效果更好。
3.4 代谢组学
3.4.1 多元统计分析 PCA结果（图4-A）表明，各组呈明显分离趋势，且QC样品（黄色）聚集在一起，反映出仪器稳定性和数据重现性较好。根据各组数据PCA-X、PLS-DA得分图（图4-B、C），对照组和模型组之间明显分开，龟龄集高剂量组和银杏叶片组与模型组分离较明显，更接近对照组，表明龟龄集和银杏叶片对模型大鼠肝脏代谢轮廓调控作用较多奈哌齐好。PLS-DA得分图的参数为R2X＝0.487、R2Y＝0.938、Q2＝0.884，对模型数据进行200次置换检验（图4-D），结果显示R2与Q2参数接近，模型斜率稍大且与纵轴截距为负值，表明模型未产生过分拟合，结果可靠。为了使组间差异最大化，消除组内变异对分类的负面影响，对对照组和模型组数据进行了OPLS-DA（图4-E），模型参数为R2X＝0.558、R2Y＝0.999、Q2＝0.874，CV-ANOVA检验P＝4.56×10−3，表明模型无过拟合，能够预测分类数据，计算各变量对OPLS-DA模型的贡献得到VIP＋S-plot图（图4-F），通过|p(corr)|值和VIP值筛选出主要差异代谢物。
3.4.2 差异代谢物分析 将筛选得到的差异变量进行结构鉴定，共指认出23个差异代谢物（表1），与对照组比较，模型组大鼠肝脏中谷氨酰胺、焦谷氨酸、葡萄糖酸、阿糖酸、苹果酸、尿嘧啶、乙酰左旋肉碱、烟酰胺、次黄嘌呤、肌苷、黄嘌呤、黄嘌呤核苷12种代谢物含量显著升高（P＜0.5、0.01、0.001）；谷氨酸、谷胱甘肽、酪氨酸、溶血磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、血小板激活因子等11种代谢物含量显著下降（P＜0.5、0.01、0.001）。龟龄集可回调所有差异代谢物，银杏叶片、多奈哌齐分别能够回调21和20个差异代谢物。以回调率评价药物对代谢物的回调程度，高、低剂量龟龄集的平均回调率分别为67.55%、30.66%，银杏叶片平均回调率为95.78%，多奈哌齐平均回调率为59.76%。高、低剂量龟龄集的总回调率分别为1 553.65%、674.54%，银杏叶片总回调率为2 011.46%，多奈哌齐总回调率为1 195.20%。
回调率＝(给药组相对峰面积－模型组相对峰面积)/(对照组相对峰面积－模型组相对峰面积)
3.4.3 代谢通路分析 将差异代谢物导入MetaboAnalyst数据库进行代谢通路富集分析，以−lgP＞1和Impact value＞0.05为条件，共筛选出5条关键代谢通路：嘌呤代谢（purine metabolism），D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢（D-glutamine and D-glutamate metabolism），精氨酸生物合成（arginine biosynthesis），丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（alanine, aspartate and glutamate metabolism），苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成（phenylalanine，tyrosine and tryptophan biosynthesis），龟龄集对上述5条代谢通路均有调节作用（图5）。
4 讨论
本研究基于D-gal合并半高脂饲料诱导的MCI大鼠模型，探讨了龟龄集对MCI大鼠肝保护作用和潜在机制。MCI大鼠肝脏出现显著肝功指标异常、肝组织病理损伤及肝脏代谢轮廓异常。龟龄集和银杏叶片能够回调2项肝功能指标。龟龄集还能显著改善肝组织病理，效果较银杏叶片好。肝脏代谢组学研究结果表明，龟龄集可回调23个差异代谢物，较银杏叶片和多奈哌齐多，但银杏叶片对差异代谢物的总回调率和平均回调率较龟龄集更高，主要原因是银杏叶片广泛的药理作用，包括抑制血小板聚集、降低血液黏度、改善微循环等，对肝组织中大量嘌呤类和脂类代谢物具有强的调节作用。综合肝功能、肝组织病理以及肝脏代谢轮廓调节作用，龟龄集和银杏叶片均表现出保肝作用，但龟龄集效果更优。
肝脏代谢组学结果显示，龟龄集对MCI大鼠肝脏5条关键代谢通路：嘌呤代谢，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢，精氨酸生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成均有调节作用。肝脏是氨基酸、溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine，LPC）合成和代谢的主要场所，肝脏功能下降必然会引起机体LPC、氨基酸的水平和代谢轮廓的变化。
嘌呤是一种氨基酸类成分，嘌呤代谢与神经系统疾病存在密切联系，如黄嘌呤及其衍生物可作为腺苷受体拮抗剂，调节神经递质和神经调节剂的释放，并调控海马血红蛋白基因表达，从而影响空间记忆[23]。研究表明帕金森患者的嘌呤类代谢物，包括肌苷、黄嘌呤核苷、黄嘌呤、次黄嘌呤含量均显著增加[24-25]。嘌呤类代谢物受黄嘌呤氧化还原酶（xanthine oxidoreductase，XOR）调控，该酶以黄嘌呤脱氢酶（xanthine dehydrogenase，XDH）和黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）2种形式存在。次黄嘌呤经XO作用生成黄嘌呤，黄嘌呤经XO作用生成尿酸。由于XDH在肝脏中大量表达，故肝脏出现损伤后，XDH可从肝细胞释放到血液循环，并被血浆蛋白酶快速转化为XO，从而增加肝脏和大脑内自由基形成，导致脑血管功能障碍和认知功能减退[26-27]。本研究中MCI大鼠出现肝脏功能下降，并伴有嘌呤类代谢物含量升高，与文献中神经退行性疾病中嘌呤类代谢物的含量变化趋势一致，龟龄集可显著下调肝脏嘌呤代谢物的含量，这可能是龟龄集发挥肝保护作用从而改善认知功能的原因之一。
前额叶皮层谷氨酸能神经传递活性低下是认知功能障碍的主要病理特征。谷氨酸（glutamic acid，Glu）-谷氨酰胺（glutamine，Gln）稳态直接影响谷氨酸能活性，是维持认知功能的重要因素[28]。研究表明，Glu的浓度会随着神经元密度和神经退行性变化而改变，AD小鼠的Glu水平显著降低，且谷氨酸能神经元变化先于-氨基丁酸能神经元，Glu水平的改变可作为MCI早期诊断的重要标志[29-30]。大脑中Glu-Gln循环和Glu-Gln水平的改变可导致谷氨酸能神经传递受损和认知功能障碍[28]，Gln还能通过调节氧化应激和炎症反应来影响神经功能，研究表明具有抗氧化特性的Gln可能会中断氧化应激和淀粉样蛋白积累的有害循环，从而减缓认知损伤的进展[31]。本研究中MCI大鼠肝脏Gln水平降低，Glu含量升高，说明其Glu-Gln稳态被打破，致谷氨酸能神经传递受损，龟龄集可调节肝脏Glu-Gln稳态发挥肝保护作用并影响认知功能。
LPC是体内磷脂代谢的中间产物，大量研究表明在药源性肝损伤、酒精性肝损伤和非酒精性脂肪性肝炎等肝疾病中均伴有LPC水平的降低，血浆LPC水平是急性肝衰竭预后不良的关键指标[32-35]。本研究中MCI大鼠肝脏LPC水平显著降低，与上述文献研究结果一致。另有研究表明，通过膳食补充Sn-2棕榈酸盐，可增加肝脏LPC及其长链脂肪酸（very long-chain fatty acids，VLCPUFAs）的合成，LPC和溶血磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidylethanolamine，LPE）作为肝脏VLCPUFAs通过转运蛋白穿越血脑屏障，增加脑内VLCPUFAs的浓度，从而改善认知行为[36]。LPE是磷脂酶A1/A2诱导的磷脂酰乙醇胺水解的脱酰产物，在嗜铬细胞瘤细胞中，LPE可通过丝裂原激活的蛋白激酶信号通路发挥神经营养激活剂的作用，并参与刺激皮质神经元的神经突生长[37-38]。有研究发现，高脂饮食诱导的脂肪肝小鼠血清LPE（18∶2）和LPE（20∶4）的水平均显著降低，且LPE还参与诱导肝细胞脂滴形成[39]。本研究中MCI大鼠肝脏LPE水平显著降低，可能与肝细胞出现脂滴空泡病理改变相关，并可能影响神经系统从而影响认知功能，龟龄集能够调节LPC和LPE水平发挥肝保护作用。
中医认为MCI的临床症状与中医学“呆病”相似，其病机为脑髓空、肝肾阴虚、气血双亏、瘀血痹阻。病位虽在脑，但却由肝肾亏虚引起，因此MCI可从肝肾论治。本研究基于肝脏代谢组学发现龟龄集能够调节肝脏脂类、氨基酸类等小分子代谢物从而影响肝脏脂代谢、嘌呤代谢和能量代谢发挥肝保护作用。课题组前期基于MCI大鼠肾脏代谢组学发现龟龄集可调节肾脏脂类、氨基酸类和牛磺酸等小分子代谢物从而影响脂代谢和能量代谢发挥肾保护作用[22]。肝和肾代谢组学研究结果表明龟龄集改善MCI可能的机制涉及肝、肾功调节，肝、肾脂代谢和氨基酸代谢调节。该结果提示可进一步靶向脂类和氨基酸类代谢物的定量分析，从而发现关键差异标志物、代谢通路以及关键靶点，为探明龟龄集靶向“肝-肾-脑”系统治疗MCI的潜在机制提供研究方向和科学依据。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：陈 乐，倪玲凡，史静超，秦雪梅．基于肝脏代谢组学研究龟龄集对轻度认知功能障碍大鼠肝保护作用 [J]. 中草药, 2025, 56(6): 1999-2008.
$广誉远(SH600771)$ $片仔癀(SH600436)$ $贵州茅台(SH600519)$
基于肝脏代谢组学研究龟龄集对轻度认知功能障碍大鼠肝保护作用
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